ミカエリス メンテン の 式。 酵素の反応速度論

酵素の活性について

ミカエリス メンテン の 式

ラインウィーバー・バークプロット ミカエリス・メンテン式は次のように表されました。 これを ラインウィーバー・バークプロットといいます。 プロットとは点を打つという意味です。 最後に実際の実験データを用いてプロットしてみます。 イーディー・ホフステープロット データのプロット手法をもう1つ紹介しておきます。 酵素の触媒効率 酵素の触媒定数を以下のように定義します。 実験データの解析 実際の実験から得られたデータを用いて、反応速度データの解析を行ってみましょう。 前提 乳酸脱水素酵素 LDH は以下の反応を触媒します。 そしてLDHはミカエリス・メンテンの式に従うこともわかっています。 内容と結果 今回の実験では反応溶液中のLDH濃度を0. 得られた吸光度の時間変化のデータから各濃度条件における反応初速度を計算し、ピルビン酸濃度に対してプロットしたものを下の図に示します。 反応初速度と基質の関係 ピルビン酸の濃度が高くなるにつれて反応初速度がだんだん横ばいになっていくのがわかります。 ピルビン酸の濃度を限りなく大きくしたときの極限値が反応の最大速度になります。 ただし、あまり正確な値は出せないでしょう。 より正確な最大速度とミカエリス定数を求めるためにはラインウィーバー・バークプロットやイーディー・ホフステープロットを用いた方が良いでしょう。 ラインウィーバー・バークプロット いよいよラインウィーバー・バークプロットに表してみます。 直線の近似式は最小2乗法による。 よって、基質濃度が比較的大きいデータを取る方が良いです。 イーディー・ホフステープロット イーディー・ホフステープロットも挙げておきます。 直線の近似式は最小2乗法による。

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酵素の化学

ミカエリス メンテン の 式

速度反応論:酵素と基質、ミカエリス・メンテン式 恒常性を保つために、生体内の反応は 適切な速度で進む。 速度の影響因子には温度、pH、酵素、基質の濃度、阻害物質の存在がある。 また、反応の進行には遷移状態を経由する。 平衡状態 酵素反応が平衡状態にあるというのは、正反応と逆反応の速度が同じということである。 平衡とは 動的平衡であり、反応が止まっているわけではなく A と B は絶えず AB に転換しており逆も起きている。 動的平衡のとき、 となる。 酵素反応はエネルギー障壁を下げるがkeqには影響しない。 反応例 個々の反応では、基質と酵素の反応は1 :1で反応する。 酵素はリサイクルされるため、全体では少量で足りる。 酵素の活性部位 活性部位=酵素の触媒部分 酵素には高い特異性、反応選択性があり、鍵と鍵穴の関係のように活性部位にぴったりとはまる物質のみ触媒する。 ミカエリス・メンテン式 ミカエリス・メンテン式は平衡状態が成立、定常状態のときに基質濃度が変化したときの酵素反応への影響を表す式である。 ミカエリス・メンテン式は、 と表すことができる。 この式を変形していくと次のようになる。 逆数をとって、 ある酵素反応において、濃度における反応速度を求めてプロットする。 その後、グラフの直線を延長しXとY切片を計算するとKm、Vmaxが分かる。 阻害 ・競合阻害 阻害物質は基質と類似の構造をもつことが多く、基質の結合部を取り合う。 活性部位を取り合うことで反応を阻害するとき、Vmaxは変わらないがKmを上げる。 反応速度を上げるためには、より多くの基質が必要である。 ・非競合阻害 活性部位を奪い合わないが、別の部位に働いて酵素の働きを下げる。 このときVmaxを下げるが、基質の結合自体は阻害しないためKmは変わらない。 競合阻害や非競合阻害では、それぞれ左のグラフの ように変化する。 酵素の活性の特徴 ・高い基質特異性、高い触媒作用 ・欠点として、タンパク質なので高温等では使えない ・酵素の作用機構が分かると、酵素をターゲットとした薬をデザインできる 酵素デザイン 酵素の活性 例 キモトリプシン p -ニトロフェノール酢酸をキモトリプシンにより加水分解させるとp -ニトロフェノールが生成する。 p -ニトロフェノールは発色するので吸光度を測定すると生成量が分かる。 下の表はその時のp -ニトロフェノール酢酸とキモトリプシンを反応させた時の検出するp -ニトロフェノールの量と反応時間の表である。 バースト相:キモトリプシン CT がCT-酢酸として飽和するまで。 定常状態:CT-酢酸から、CTの再生スピードが全体の速度を決定する。 p -ニトロフェノール酢酸とキモトリプシン CT が反応すると、p -ニトロフェノールとCT-酢酸を生成する。 この場合、最初の方はキモトリプシンがどんどん反応していく。 この部分がバースト相である。 しかし、キモトリプシンが全て反応して飽和状態になると、p -ニトロフェノールが生成するにはCT-酢酸からキモトリプシンへと再生されるまで待たないといけない。 キモトリプシンが再生されると再びp -ニトロフェノール酢酸と反応して、p -ニトロフェノールを生成する。 アロステリック調節 酵素などに活性部位以外に物質が結合し、活性が強くなったり弱くなったりする。 そのとき、酵素に結合し形を変える物質を アロステリックエフェクター アロステリック酵素 という。 これはフィードバック調節の機構の一つである。 フィードバック阻害とはある生合成経路の最終産物がその経路の特定の酵素活性を阻害する現象である。 例 酵素a、b、c、d によって触媒されるAからDまでの反応 上の図では、高濃度の E がB からC への転換を阻害する。 つまり、Eは特異的に酵素b と結合し阻害する能力をもっている。 このように、産物Eは酵素b の 負のアロステリックエフェクターまたは アロステリック阻害剤として働く。 その結果、酵素b のフィードバック阻害を介して E自身の生合成を調節する。

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非線形薬物の投与量決定

ミカエリス メンテン の 式

阻害剤の反応速度論 pdfファイルの 阻害剤 inhibitors は酵素と相互に作用し,その反応効率を低下させる合成物または天然に存在する化合物である 1。 多くの有毒な化合物は酵素阻害剤で,生体に大きな影響を与えるため,抗生物質,農薬,除草剤などに使われている。 一方,天然の生理的な阻害剤は生体調節や生体防御等のために働いている。 阻害剤は異なる機構で酵素と相互作用するが,酵素反応速度論はこれらの機構を区別することのできる重要な手段となる。 ここでは阻害機構の特徴や酵素反応速度式を導出し,さらに,阻害定数(解離定数) K iを決定する方法を述べる。 1 Copeland, R. , "Evaluation of Enzyme Inhibitors in Drug Discovery: A Guide for Medicinal Chemists and Pharmacologists. " Wiley-Interscience, 2005. 以下の解説では次の略号を使用する。 その速度定数は k 1である。 ついで,ESは速度定数 k 2で分解するか,速度定数 k catで反応産物Pになる。 全過程は 1. 1 のように表わされる。 1 以下, 定常状態近似を用いて反応速度(v)を求めると,次の ミカエリス・メンテン( Michaelis- Menten)の式が得られる。 2 ここで, K mはミカエリス定数と呼ばれる。 3 Michaelis-Mentenの式 1. 2 を図で表すと次のようになる。 一般にV maxは酵素濃度に比例するが,酵素濃度一定の条件で測定すれば,V maxは定数と見なせる。 ・最大反応速度V max: 1秒間に酵素が変化させうる基質のモル数で表され,酵素の 作用回転数 turn over という。 ・ミカエリス定数 K m: ミカエリス・メンテンの式 1. 一方,ESの解離定数を K S とすると, K Sは次のように表される。 3 と 2. したがって, K mは 酵素と基質の親和性を表わすパラメーターと考えてよい。 K m値が小さい程 ESの解離が起きにくく,すなわち,EとSが結合し易いことになる。 2 を変形すると,1/vと1/[S]のプロットは次のように直線となる。 これを Lineweaver-Burkの式という。 2 1/[S]に対して1/vをプロットすると,直線のX切片から K m,Y切片からV maxが求まる。 V maxは直線の傾き = K m/V max から求めてもよい。 図2 Lineweaver-Burkプロット Lineweaver-Burkプロット以外に,Michaelis-Mentenの式を変形したいくつかのプロット法が知られている。 ・Hanes-Woolfプロット 2. 3 阻害の形式 拮抗阻害 Competitive Inhibition ・阻害剤は基質と同じ部位に結合する阻害形式である。 ・基質と阻害剤が活性部位を競って結合するため, K m値は大きくなるが,V maxは変化しない。 非拮抗阻害 Non-competitive Inhibition ・阻害剤が活性部位とは異なる部位に結合して酵素の立体構造を変え,基質が生成物に変わるのを抑える阻害形式である。 また、酵素基質複合体(ES)にも結合して阻害するため,基質濃度を高くしても阻害は解消されない。 ・V maxが低下するが,阻害剤は直接活性部位に結合しないため基質の親和性に変化がなく, K m値は変化しない。 不拮抗阻害 Uncompetitive Inhibition ・阻害剤が遊離の酵素とは結合せず,酵素基質複合体(ES)とだけ結合するような阻害形式である。 ・ K m値とV maxは両方とも変化する。 図3 酵素の阻害の仕組み これらを式で示すと,図4のようになる。 反応速度はそれぞれ右の式ようになる 拮抗阻害 (3. これを混合型非拮抗阻害 Mixed non-competitive inhibition という。 3 不拮抗阻害 3. 阻害形式はこのプロットで区別できる。 拮抗阻害 不拮抗阻害 非拮抗阻害 混合型 拮抗および非拮抗阻害ではLineweaver-Burkプロットの直線の傾きが大きくなるが,不拮抗阻害の場合は変化しない(表1)。 阻害剤のあるなしでの直線の交点は次のような特徴がある(図5も参照)。 5 2 Dixon, M. , The Determination of Enzyme Inhibitor Constants. Biochem. , 55, 170-171 1953 ; Dixon, M. , The graphical determination of Km and Ki. Biochem. , 129, 197-202 1972 ; Cornish-Bowden, A Simple Graphical Method for Determining the Inhibition Constants of Mixed, Uncompetitive and Non-Competitive Inhibitors. Biochem. , 137, 143-144 1974. 【手 順】 2つ以上の基質濃度で,種々の濃度の阻害剤を酵素に作用させて反応速度を測定する。 直線の交点が K i値である。 Morrison 1969 3 によって提案された阻害の一般式 4. 15 は,酵素と強く結合する阻害剤の場合に適用できる。 1 Morrisonの式 3 Morrison, J. , Kinetics of the reversible inhibition of enzyme-catalysed reactions by tight-binding inhibitors. Biochim Biophys Acta, 185, 269-286 1969 【手 順】 一定濃度の酵素および基質に対して,種々の濃度の阻害剤を作用させ,酵素活性比を計算する。 非線形curve-fitting法によって,見かけの K i( K i app)が求まる(図7)。 を参照。 図7 Morrisonの式を用いるcurve-fitting 見かけの解離定数 K i appから真の解離定数 K i を求めるには,次の式を用いる。 拮抗阻害: 4. 2 非拮抗阻害: 4. 4 Hendersonプロット Henderson 1972 4 はMorrisonの式を直線の式に直し,グラフの直線の傾きから K iを導けることを示した。 Hendersonの一般式は次のようになる。 5 図8 Hendersonプロット 4 Henderson, P. , A linear equation that describes the steady-state kinetics of enzymes and subcellular particles interacting with tightly bound inhibitors. Biochem. , 127, 321-333 1972. 【手 順】 一定濃度の酵素および基質に対して,種々の濃度の阻害剤を作用させ,酵素活性比を計算する。 式 4. Hendersonの方法はコンピュータを使用しなくて済むが,式の両辺にv 0が入っているためv0の正しい測定値が必要になる。 v 0が不正確な場合はv i値が正しくても計算値が大きくずれ,直線にならなくなる可能性が示唆されている Henderson, 1973。 Hendersonプロットによる阻害様式の判定は,基質濃度を増加した時の直線の傾きの変化で調べる(図9)。 拮抗阻害では[S]の増加に伴い傾きも増加,不拮抗阻害では減少する。 06だったとする。 となる筈。 解離平衡定数は次のようになる。 おおよその値を見積もるのには使える。 図10 解離平衡定数を用いる方法 非線形解析法による見かけの K i( K i app)の計算 Morrisonの式を使ったcurve-fittingにより,見かけの解離定数 K i appを求めます。 使うツールとして Microsoft Excelが必要です。 また,Excelの solver機能を利用しますので,前もってアドインしておいてください。 【手 順】 1 酵素濃度一定の条件で,種々の濃度の阻害剤を加えることによる反応速度を測定する。 5 K i app値を設定しなおして,上記の差の二乗値の総和が最小になるようにする。 この段階で solver機能を利用する。 6 差の二乗値の総和が solver機能で設定した収束値以下になるまで,再計算する。 その時の K i app値が求める値である。 Excelを使った計算例。 以下,curve-fittingの例を示す。 このExcelファイルはするとダウンロードできます。 適当に名前をつけて保存後,お使いください。 使い方はこの図の下に示します。 2 K i app値を適当に設定する。 初期値は0. 右図の阻害曲線のデータ点のうち,大きく外れているものは,表の右端のデータ処理のセルに0を入力してください。 4 実行を押すと1回目の計算が行われます。 Sum of squaressのセルの数値が変化すると同時に K i app値が変化します。 右図の阻害曲線の曲線がデータ点に近づいていればOKです。 5 何度か実行を押して,Sum of squaressのセルの数値が下がらなくなれば終りです。 その時の K i app値が求める値です。 6 閉じるを押し,データを別名で保存して終了してください。 参考までに,下のほうに,Hendersonの式を用いて線形解析したデータも載せています。 上の数値と連動して変化します。

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